Vitrifikacija ni bila ena sama iznajdba. Razvila se je, ko so raziskovalci reševali zaporedje različnih problemov pri celicah, zarodkih, organih in nazadnje pri človeški biostazi.
Cilj zveni preprosto: ohladiti tkivo bogato z vodo v steklo, ne da bi nastal škodljiv led.
Izvedba ni preprosta. Krioprotektanti lahko so strupeni. Nalaganje jih lahko deformira celice. Veliki predmeti se ohlajajo neenakomerno, kopičijo napetost in jih je veliko težje ponovno ogreti.
Sodobne postopke je zato treba obravnavati kot sisteme, ne kot recepture. Njihova kakovost je odvisna od kemije, perfuzije, temperature, časa, geometrije in meritev, ki delujejo skupaj.
Pred vitrifikacijo: hlajenje je povzročalo drugo poškodbo
Zgodnja krioprezervacija je v bistvu pomenila zamrzovanje. Ohlajanje je upočasnilo kemijske procese, vendar se je voda kristalizirala v led.
Led izloča soli in druge snovi v preostalem tekočem delu. Celice lahko zato hkrati doživijo mehansko premikanje, ekstremne koncentracije snovi, dehidracijo in poškodbe membrane.
Hitrejše hlajenje lahko naredi kristale manjše, vendar običajna voda zahteva izredno hitre hitrosti, da postane steklo brez kemijske pomoči. To deluje le pri izredno tankih vzorcih.
Zgodovinski problem ni bil le doseganje nizke temperature. Bilo je doseganje te temperature brez dovoljevanja, da bi se voda reorganizirala v škodljive kristale.
1937 do 1938: prva kinetična vitrifikacijska eksperimenta
Basile Luyet je vitrifikacijo predlagal kot strategijo za ohranjanje bioloških vzorcev v 1937.
V 1938 sta Luyet in Eugene Hodapp poročala o obnovitvi gibljivosti v semenčicah žab, ki so bile izpostavljene tekočemu zraku po dehidraciji z koncentrirano saharozo.
izvirni poskusizvirni poskusodvisalo je od mikroskopskih filmov in ekstremne hitrosti hlajenja. To je pokazalo fizično možnost, ne pa skalabilnega protokola za organe.
Ta pristop se zdaj imenuje kinetična vitrifikacija: prehitre ohladitve preprečijo kristalizacijo tako, da se toplota odstrani hitreje, kot lahko led nukleira in raste.
Zaradi velikosti to ne deluje. Površina raste počasneje od volumna, zato sredica velikega vzorca ne more slediti površini dovolj hitro.
1949: glicerol spremeni problem
Christopher Polge, Audrey Smith in Alan Parkes sta v 1949 odkrila, da glicerol lahko ščiti spermatozoide med ohranjanjem pri nizkih temperaturah.
NjihovaNature report je uveljavila praktično pomembnost penetrantnih krioprotektivnih sredstev.
Te molekule vstopajo v celice, vežejo vodo in zmanjšujejo količino ledu, ki se tvori pri dani temperaturi. Zmanjšujejo tudi škodljivo koncentracijo raztopljenih snovi med zamrzovanjem.
Odkritje je preobrazilo kriobiologijo, ker je hitrost ohlajanja prenehala biti edini spremenljivka nadzora. Kemijska sestava je lahko spremenila fazno vedenje vode.
Vpeljalo je tudi novo optimizacijsko vprašanje. Večja količina krioprotektanta učinkoviteje preprečuje led, vendar povečuje kemijsko in osmotsko škodo.
1959 do 1968: več sredstev in postopno polnjenje
V 1959 sta James Lovelock in Marcus Bishop poročala, da dimetil sulfoksid ščiti več vrst celic pred poškodbami zaradi zamrzovanja.
DMSO je prehajal skozi nekatere membrane bolj sproti kot glicerol. Razširil je razpon celic, ki jih je bilo mogoče krioprotektivno zaščititi, in se še vedno široko uporablja v laboratorijski in klinični krioprezervaciji.
Nato je John Farrant raziskoval dvig koncentracije krioprotektanta ob znižanju temperature, tako da je tkivo ohranjal v koncentrirani tekočini brez namernega tvorjenja ledu.
To je predvidevalo ključno značilnost sodobnih protokolov: vnašanje krioprotektanta v korakih, pri nizki temperaturi, namesto da bi se topla tkiva hkrati izpostavila polni koncentraciji.
Postopno vnašanje omejuje osmotski šok. Nizja temperatura zmanjšuje hitrost mnogih kemijskih reakcij in lahko naredi sicer škodljivo izpostavljenost bolj zdržljivo.
V 1968 so poskusi pokazali, da lahko rdeče krvničke dosežejo temperaturo tekočega dušika brez vidne ledovine pri dovolj visoki koncentraciji glicerola.
Konceptualni elementi so bili prisotni. Manjkala je le praktična metoda, kako jih uporabiti na kompleksnih, vaskulariziranih tkivih.
1984: vitrifikacija postane strategija za organe
Članek v 1984»Vitrifikacija kot pristop h krioprezervaciji«je vitrifikacijo preoblikoval v resno možnost za shranjevanje organov.
Strategija se je pogosto imenovala ravnotežna vitrifikacija. Namesto da bi zahtevala nemogočo hitrost hlajenja, uporabi dovolj krioprotektanta, da je kritična hitrost hlajenja dosegljiva v večjem sistemu.
Ta sprememba je odkrita tri povezane omejitve:
- Rešitev mora odporovati ledu pri dosegljivih hitrostih hlajenja in segrevanja.
- Organ mora prenesti polnjenje in izpraznitev te raztopine.
- Krioprotektant mora doseči vsak predel pred začetkom hlajenja.
Ena sestava lahko v epruveti deluje odlično, v organu pa spodleti, ker so se spremenili vaskularni upor, razdalja difuzije ali toksičnost in tako spremenili rezultat.
1985: živi zarodki se vrnejo iz steklastega stanja
William Rall in Gregory Fahy sta poročala oohranjanju mišjih zarodkov brez ledu pri -196°C v 1985.
To je bila odločilna biološka demonstracija. Žive jedrne sesalske celice so preživele hlajenje in ponovno segrevanje skozi popolnoma vitrificirano stanje.
Zarodki so še majhni. Njihova temperatura in koncentracija se lahko hitreje in enakomerno spreminjata v primerjavi z odraslim organom.
Rezultat je potrdil metodo, hkrati pa naredil problem merila bolj viden.
Problem merila se razdeli na štiri podprobleme
1. Toksičnost krioprotektanta
Koncentracija, potrebna za vitrifikacijo, lahko moti beljakovine, membrane in celično presnovo. Toksičnost je odvisna od sredstva, koncentracije, temperature, časa izpostavljenosti in vrste tkiva.
To pomeni, da »manj toksičen« ni lastnost ene same molekule. Gre za lastnost celotnega protokola polnjenja in izpraznitve.
2. Osmotski stres
Dodajanje koncentrirane raztopine potegne vodo iz celic. Odstranjevanje pa lahko vodo vrne nazaj prehitro.
Sodobni protokoli uporabljajo stopničaste spremembe koncentracij, nosilne raztopine, nadzor temperature in nepenetrantne snovi, da ohranijo odstopanja volumna znotraj dopustnih mej.
3. Neenakomerna dostava
Organ ni posoda enakomerne tekočine. Krioprotektant potuje skozi žile, prehaja kapilarne stene in difundira skozi tkivo.
Strdki, oteklina, žilne bolezni, ishemija in krvno-možganska pregrada lahko pustijo nekatere regije pod koncentracijo, ki je potrebna za zatiranje ledu.
Zato sodobniperfuzijski merijo tlak, pretok, temperaturo in koncentracijo venskih žil namesto da bi se zanašali le na prostornino raztopine.
4. Toplotni gradienti
Velik predmet se ohlaja od zunaj navznoter. Različne temperature povzročajo različne hitrosti krčenja.
V bližini in pod steklasto prehodno točko material ne more hitro sprostiti napetosti. Če napetost preseže njegovo mehansko trdnost, lahko pride do nastanka razpok.
Raztopina je bila ohlajena s kontrolirano hitrostjo, žarjena v bližini Tg in počasneje spuščena skozi steklasto območje. Te principe zdaj oblikujejoračunalniško nadzorovano ohlajanje človeka.
"1990" in "2000": mešanice nadomeščajo mišljenje z enim samim zdravilom
Noben enoten krioprotektant ni optimiziral vseh zahtev. Raziskovalci vse bolj zdrujujejo prodorne agente, tako da lahko vsak prispeva, ne da bi dosegel svojo najslabšo individualno koncentracijo.
Rešitve nosilcev so nadzorovale ione, pH in osmotne razmere. Neprepustni polimeri so vplivali na vedenje vode v tkivu in na vedenje žil.
Sintetični blokatorji ledu so ciljali na heterogeno nukleacijo in rast ledu. Zmanjšali so odvisnost od samega koncentriranja krioprotektantov z uporabo sile.
Rešitve, kot so VS55 in kasneje M22, so predstavljale sistemsko inženirstvo: več agensov, blokatorjev ledu in pazljivo zasnovano kemijo nosilcev, ki so bili združeni z opredeljenimi protokoli perfuzije in toplotnimi protokoli.
V2004 pregled vitrifikacije organov je opisan napredek pri zmanjševanju toksičnosti, poškodb zaradi hlajenja, kontroli nukleacije in perfuziji organov.
Pomemben napredek ni bil v tem, da je toksičnost izginila. Raziskovalci so se naučili porazdeliti breme med kemijo, časom in temperaturo.
Poskusi na kunčjih ledvicah: pomembni in lahko pretirano poudarjeni
Delo na ledvičnem tkivu kunca je pokazalo, da je vaskulariziran organ sesalca mogoče napolniti z zapleteno vitrifikacijsko raztopino, ohladiti v steklasto stanje, ponovno segreti in presaditi.
Eden od poročenih ledvic je podpiral kunca kot edino funkcionalno ledvico v daljšem obdobju.
Ta rezultat je pomemben, ker je prešel iz mikroskopskih vzorcev v funkcijo organa. Ni pa vzpostavil zanesljive klinične postopke.
V kasnejši literaturi je navedeno, da zanesljivega uspeha presaditve v daljšem obdobju ni bilo mogoče dosledno doseči. Razdeljevanje, toksičnost in konvencionalno površinsko segrevanje so ostali omejujoči dejavniki.
To je pravilno epistemično stanje: pomemben dokaz koncepta z vprašanjem ponovljivosti in merila.
2015: kakovost ohranitve je vidna na sinaptični ravni
Krioprezervacija z aldehidno stabilizacijo je združila kemijsko fiksacijo, perfuzijo s krioprotektantom in vitrifikacijo v možganih kuncev in prašičev.
V študiji2015 so poročali o jasnih membranah, sinapsah, veziklih, mielinu in notranjih strukturah po ponovno segrevanju in pripravi za elektronsko mikroskopijo.
Prikazalo je, da se lahko izjemna nevronska ultrastruktura ohrani skozi cikel shranjevanja brez ledu tudi v velikih možganih.
Ni prikazalo možnosti uspešnega oživljanja. Aldehidna fiksacija namerno prečno poveže biološki material in je nezdružljiva z običajnim obnovitvijo živih funkcij.
Poskus je zato odgovoril na strukturno vprašanje, ne pa na vprašanje popolnega oživljanja.
Njegov širši prispevek je bil metodološki: ohranitev je treba ocenjevati z pregledovanjem struktur, ki so zanimive, ne le z opazovanjem, da vzorec izgleda steklast.
2023: nanogrevanje rešuje ponovno segrevanje v podganjih ledvicah
Hladenje je le polovica reverzibilne krioprezervacije. Ponovno segrevanje je pogosto težje.
Če je segrevanje prepočasno, se lahko led med devitrifikacijo povečuje. Če toplota prihaja predvsem s površine, lahko temperaturni gradienti organ poškodujejo.
Nanogrevanje obravnava obe težavi tako, da razporedi nanočestice železovega oksida po žilah in jih segreje z izmeničnim radiofrekvenčnim magnetnim poljem.
V 2023 so raziskovalcivitrificirali podganje ledvice, jih shranjevali do 100 dni, nanogrevali jih in jih presadili.
Obnovljene ledvice so v prejemnikih, ki nimajo lastnih ledvic, v času poročanega obdobja spremljanja obnovile življenjsko pomembno ledvično funkcijo.
Dosežek ni temeljil le na segrevanju. Raziskovalci so prešli na manj toksično formulacijo in modelirali nalaganje krioprotektanta, da bi izboljšali koncentracijo v tkivu.
To je ponavljajoča se poučnica v zgodovini vitrifikacije: reševanje enega ozkega grla odkrije naslednje, uspešno okrevanje pa zahteva celoten verižni proces.
2024 do 2026: večji fizikalni sistemi in funkcionalno živčno tkivo
V 2024 so raziskovalci poročali ofizikalni vitrifikaciji na merilo človeškega organa v sistemih od 0.5 do 3 litrov.
Združili so notranjo termometrijo, žarjenje, nadzorovano ohlajanje in pregled z mikro-CT. Prav tako so demonstrirali nanosegrevanje v volumnah do 2 litrov.
Največji dosežki so bili predvsem fizikalni. Izogibanje vidni ledu in razpokam je nujno, vendar ne zagotavlja biološkega okrevanja človeškega organa velikosti človeškega organa.
V 2026 jeraziskava v reviji PNAS poročala o kratkotrajnem funkcionalnem okrevanju odraslega mišjega hipokampnega tkiva po vitrifikaciji in ponovno segrevanju.
Raziskava je merila morfologijo, odzivnost mitohondrijev, živčno vzburljivost, sinaptično prenosljivost in dolgotrajno povečanje moči.
Vključila je mišje možganske rezine in priprave celotnega možganov z nizkim donosom, ne pa človeških možganov. Njeno pomembnost je ožja, vendar še vedno pomembna.
Prikazala je, da lahko odraslo sesarsko živčno tkivo po ustavitvi molekularne gibljivosti v steklastem stanju obnovijo elektrofiziološke funkcije.
Človeška biostaza podeduje to znanost pod težjimi pogoji
Poskusi shranjevanja organov se začnejo z zdravim tkivom, nadzorovanim časom in načrtovanim dostopom do žilnega sistema.
Človeška biostaza se začne po pravni smrti. Bolezen, topla ishemija, strjevanje, otekanje, transport in žilne bolezni lahko vsi ovirajo dostavo krioprotektanta.
Neposredni cilj je strukturna ohranitev za morebitno prihodnjo popravo, ne pa trenutno reverzibilno presaditev.
Razlika je v tem, zakaj laboratorijske trditve ni mogoče neposredno prenesti v trditve o pacientih.
Kako je Tomorrow.bio prilagodil vitrifikacijo za terenske razmere
Tomorrow.bio je premaknil celotno telesno krioprotektivno perfuzijo v specializirana reševalna vozila. Postopek lahko se začne v bližini pacienta namesto da bi čakali na prevoz v Švico.
To spremeni pomemben vhod, ki ga kemija ne more popraviti: količino ishemije pred perfuzijo.
Trenutni protokol uporablja kemijo raztopine na osnovi VM-1, prilagojeno za terensko krioprotekcijo in kasnejši transport s suhim ledom.
Program raziskavEuropean Biostasis Foundation je preizkusil VM-1 v simuliranih pogojih po smrti, vključno s tremi urami tople ishemije.
Program je meril lomni količnik venskih žil, čas perfuzije, spremembo teže, krčenje možganov in nastanek ledu ter preizkušal spremembe v perfuzatu in postopku.
To je praktična meja za človeške primere: ne gre za to, ali lahko idealna raztopina vitrificira, temveč kako dobro lahko resničnega ishemičnega pacienta perfundiramo.
Merjenje je postalo del postopka
Zgodnje raziskave vitrifikacije so pogosto ugotavljale uspeh s pomočjo preglednosti, kalorimetrije, rentgenske difrakcije, preživetja ali funkcije po ponovno segrevanju.
Človeška biostaza danes ne more uporabljati okrevanja kot končni cilj. Zato potrebuje nedestruktivne in vzorčene meritve kakovosti ohranitve.
Tomorrow.bio CT preiskuje vsakega pacienta pri isti temperaturi tekočega dušika, da oceni porazdelitev krioprotektanta in identificira led ali makroskopske napake v standardiziranih pogojih.
S samostojnim soglasjem lahko nevronski mikrovzorci podpirajo elektronsko-mikroskopsko oceno membran, sinaps in lokalne ultrastrukture.
Te metode in njihove omejitve so opisane vpostopkih kontrole kakovosti v biostazi.
Merjenje spreminja tudi razvoj samega postopka. Ko postane napaka vidna in primerljiva med primeri, lahko kemija in protokol usmerijo spremembe v njeno odpravo.
Kaj se je izboljšalo, in kaj še ni bilo rešeno
Sodobna vitrifikacija je dosegla nekaj, kar zgodnji zamrzovalni postopki niso mogli:
- Zamrzovanje brez ledu številnih celic, zarodkov in majhnih tkiv.
- Funkcionalno okrevanje vitrificiranih živalskih organov v opredeljenih poskusih.
- Ohranitev strukture na sinaptični ravni v fiksiranih sesalčjih možganih.
- Računalniško nadzorovano hlajenje in žarjenje večjih sistemov.
- Volumetrično ponovno segrevanje s tehnologijami, kot je nanosegrevanje.
- Metode CT in elektronske mikroskopije za merjenje dejanskih izidov ohranitve.
Niso dosegli reverzibilne zamrzovalne ohranitve celotnega človeškega telesa.
Preostali problemi vključujejo postmortalno ishemijo, neenakomerno perfuzijo, toksičnost krioprotektantov, učinke krvno-možganske pregrade, toplotne gradiente v celotnem telesu, preprečevanje lomov in varno enakomerno ponovno segrevanje.
Tudi uspešna ohranitev strukture bi pustila prihodnje probleme popravila, oživljanja in zdravljenja prvotnega vzroka smrti.
Te razlikovanja so razvita vtehničnih izzivih za reverzibilno krioprezervacijo.
TL;DR: Vitrifikacija se je izboljšala z boljši uporabo krioprotektantov, perfuzije, nadzora ledu, hlajenja, segrevanja in merjenja strukture. Nekateri problemi so rešeni na majhnih merilih, medtem ko ostaja nerešena reverzibilnost celotnega človeškega telesa.
Raziščite to praktično orodje
Uporabite interaktivno orodje za raziskovanje vprašanja v tem članku.
Nalaganje interaktivnega orodja...
Dodatno branje