Po krioprotektivni perfuziji pacienta ne položijo preprosto v tekoči dušik.
Pacient je več dni v računalniško vodenem temperaturnem programu. Senzorji, nameščeni v telesu, pokažejo, ali se posamezna anatomska področja ohlajajo enakomerno oziroma ali med njimi nastajajo nevarne temperaturne razlike.
Med ohlajanjem se spreminjajo tudi tehnični izzivi. Zgodnje hlajenje naj omeji nastajanje ledu. V bližini steklastega prehoda in pod njim postaneta natančnost in enakomernost temperature pomembnejši od hitrosti.
Zakaj je nadzorovano hlajenje potrebno
Krioprotektivna sredstva znižajo hitrost hlajenja, potrebno za preprečitev ledu. Tkivom z veliko vode omogočijo prehod v zelo viskozno steklasto stanje namesto obsežnega nastajanja ledenih kristalov.
Temperatura steklastega prehoda, označena s Tg, je odvisna od sestave in koncentracije raztopine ter uporabljene merilne metode. Gre za razpon, ne za eno univerzalno biološko mejo.
Za raztopine, pomembne pri krioprezervaciji človeka, je to območje običajno okoli -120°C do -135°C.
Nad tem območjem lahko prepočasno hlajenje omogoči nastanek in rast kristalov ledu. Pod tem območjem postaja snov vse bolj trdna in krhka.
Če se površinska tkiva ohlajajo precej hitreje kot sredica, se posamezni deli telesa neenakomerno krčijo. Nastala termomehanska napetost lahko povzroči razpoke.
Zato je potek hlajenja natančno določen: pred vitrifikacijo je treba ohlajati dovolj hitro, nato pa med prehodom pacienta v steklasto stanje uravnavati temperaturne razlike in hitrost ohlajanja.
Glej razliko med zamrzovanjem in vitrifikacijo za razlago osnovnega faznega obnašanja.
Prva generacija hladilne komore
Prvi sistem Tomorrow.bio, hladilna komora V1, je postavil osnovno zasnovo nadzorovanega ohlajanja celotnega telesa.
Pacienta namestijo v posebno izolirano komoro. Računalnik nadzoruje kriogeno okolje v komori, termočleni pa merijo temperaturo na več mestih.
Krmilnik sledi programirani temperaturni krivulji, namesto da bi ves čas deloval z največjo hladilno močjo. Vsak senzorski kanal se zapiše kot del temperaturne zgodovine pacienta.
To je že bistveno drugače od neposredne potopitve. Naprava lahko ohlajanje upočasni, ustavi ali spremeni razmere v komori glede na dejanski odziv pacientovega telesa.
Sistem druge generacije z Dewarjevo posodo
Sistem druge generacije podjetja Tomorrow.bio nadzorovano ohlajanje izvaja v posebej zasnovani Dewarjevi posodi.
Pacient med postopkom ostane v Dewarjevi posodi, njen posebej zasnovani pokrov pa združuje hladilno opremo, računalniško krmiljenje, ventile, priključke za senzorje in prehode za termočlene.
Termočleni so nameščeni na več mestih v telesu pacienta. Dodatni senzorji spremljajo temperaturo v Dewarjevi posodi.
Sistem torej ne spremlja le nastavljene ciljne temperature. Spremlja, kako hitro se ohlajajo posamezna merjena področja pacientovega telesa.
Računalnik prilagaja temperaturne razlike in hitrost ohlajanja v Dewarjevi posodi, da odčitki ostanejo znotraj meja, ki jih določa protokol.
Veliko telo med hlajenjem ne more biti povsem izotermno. Praktični cilj je zmanjšati temperaturne razlike ter preprečiti, da bi se katero koli merjeno področje ohlajalo nevarno hitreje ali počasneje od drugih.
Zasnova Dewarjeve posode zmanjšuje tudi premikanje pacienta med nadzorovanim ohlajanjem in kriogenim shranjevanjem. Takšna zaprta zasnova lahko okoli pacienta ohranja stabilno in simetrično okolje.
Nastavljena temperatura ni temperatura pacienta
Krmilnik lahko okolje hitro ohladi. Ne more pa doseči, da bi sredica človeškega telesa takoj dosegla enako temperaturo.
Toplota mora potovati iz globljih tkiv proti površini. Na časovni zamik vplivajo telesna zgradba, sestava tkiv, porazdelitev krioprotektanta in položaj senzorja.
Zato en senzor v komori ne zadostuje. Nazivno okolje -130°C ne dokazuje, da je vsak merjen del pacientovega telesa dosegel -130°C.
Krmilni sistem mora upoštevati tako absolutno temperaturo kot razlike med kanali. Najpočasneje in najhitreje ohlajajoča se točka ter celoten temperaturni razpon dajejo različne pomembne informacije.
Pomembni so tudi kalibracija termočlenov, njihova pravilna namestitev in neprekinjeno delovanje. Neverjetne odčitke oziroma okvare senzorjev je treba označiti, ne pa jih brez pojasnila vključiti v povprečno krivuljo.
Tristopenjski temperaturni program podjetja Tomorrow.bio
Trenutni protokol ima tri ločene faze. Te vrednosti so delovne ciljne vrednosti za uporabljeno opremo in krioprotektivni pristop, ne pa univerzalne konstante za vsak sistem vitrifikacije.
1. Hiter spust proti -130°C
V prvi fazi pacienta s temperature suhega ledu ohlajajo proti približno -130°C, in sicer tako hitro, kot to varno dopuščajo izmerjene temperaturne razlike.
Hitrost je tu pomembna, ker lahko slabše zaščitena področja še vedno tvorijo led, preden tkivo preide v steklasto stanje.
Računalnik ne sledi le pretečenemu času. Spremlja termočlene in prilagaja hladilno okolje okrog pacienta.
2. Nadzorovan dvig proti -120°C
Ko temperatura doseže okrog -130°C, zmanjšajo aktivno hlajenje in pacienta pustijo, da se naravno segreje proti približno -120°C.
To je faza uravnovešanja napetosti. V bližini Tg ima krioprotektirana snov še dovolj molekularne gibljivosti, da lahko popusti del nakopičenih mehanskih napetosti.
Dvig temperature omogoči tudi zmanjšanje razlik med toplejšimi in hladnejšimi območji, preden snov preide v bolj trdno steklasto stanje.
Ta faza ne odpravi že obstoječe biološke poškodbe. Njen namen je ožji: zmanjšati temperaturne gradiente in napetosti, ki jih povzroči neenakomerno krčenje.
3. Spust na -196°C s hitrostjo približno 1°C na uro
Od približno -120°C je ciljna hitrost spuščanja približno 1°C na uro, dokler pacient ne doseže temperature tekočega dušika.
Ta zadnji, 76 stopinj dolg interval traja približno tri dni, brez upoštevanja zadržkov in prilagoditev krmiljenja.
Ohranjanje hitrosti 1°C na uro pri velikem telesu z neenakomerno porazdeljeno temperaturo je vprašanje regulacije, ne zgolj nastavitve časovnika.
Krmilnik mora neprekinjeno prilagajati razmere v Dewarjevi posodi, da se območja, ki jih merijo notranji termočleni, ohlajajo usklajeno in brez prevelikih temperaturnih razlik.
Če eno območje pri ohlajanju zaostaja, lahko dodatno ohlajanje okolja drugo območje ohladi preveč. Natančno uravnavanje pomeni usklajevanje odčitkov vseh senzorjev, ne osredotočanja na en sam odčitek.
Zakaj je faza uravnovešanja napetosti znanstveno utemeljena
Raziskave vitrifikacije večjih vzorcev izpostavljajo dve nasprotujoči si tveganji: prepočasno hlajenje nad Tg in prevelike mehanske napetosti v bližini Tg in pod njim.
Študija vitrifikacije na ravni človeškega organa iz leta 2024 je z meritvami več notranjih sond pokazala, da uravnovešanje napetosti zmanjša temperaturne razlike, preden snov preide v steklasto fazo.
Ista študija je ugotovila, da počasno hlajenje pod območjem uravnovešanja napetosti pomaga preprečiti ponovno nastajanje velikih gradientov in napetosti.
Ločena termomehanska raziskava je ugotovila, da uravnovešanje napetosti v bližini Tg bistveno spremeni preostale napetosti in zmanjša njihovo odvisnost od predhodne hitrosti hlajenja.
Te študije podpirajo osnovno strategijo nadzora. Vendar ne potrjujejo samostojno vsake posamezne nastavljene vrednosti v protokolu Tomorrow.bio za celotno telo.
Celotno človeško telo je večje in bolj neenotno od laboratorijskih raztopin ali organov. Neposredni temperaturni zapisi in slikanje po ohlajanju ostajajo nujni.
Kaj računalnik zapisuje
Ključni rezultat ni zgolj sporočilo »ohlajanje končano«. Je celotna časovna vrsta podatkov iz vsakega temperaturnega kanala.
V zapisu morajo biti navedene hitrosti ohlajanja, zadržki, dvigi temperature, temperaturne razlike med senzorji, ukrepi krmilnika, alarmi in vsak odklon od načrtovane krivulje.
Ti podatki postanejo del ocene kakovosti krioprezervacije.
Po ohlajanju lahko standardizirano CT-slikanje pri temperaturi tekočega dušika odkrije porazdelitev krioprotektanta, led, večje deformacije in razpoke, ki jih temperaturni podatki sami ne razkrijejo.
Zakaj postopek zaključijo pri temperaturi tekočega dušika
Pri normalnem atmosferskem tlaku dušik vre pri približno 77,34 kelvina, torej približno -195,8°C, kot navaja NIST Chemistry WebBook.
Shranjevanje v tekočem dušiku je pasivno. Dokler je v posodi dovolj tekočine, njeno vrelno ravnotežje ohranja stabilno kriogeno okolje brez mehanskega hlajenja.
Nadzorovano ohlajanje se konča šele, ko je pacientovo telo temperaturno pripravljeno na to stabilno stanje. Shranjevanje ni nadomestilo za postopek ohlajanja.
Zasnova ter prednosti in slabosti naslednje faze so opisane v prispevku o sodobnih kriogenih Dewarjevih posodah in shranjevanju pri vmesnih temperaturah.
Povzetek: Tomorrow.bio uporablja računalniško vodeno hlajenje in notranje temperaturne senzorje. Postopek vključuje hitro ohlajanje v bližini steklastega prehoda, fazo sproščanja termičnih napetosti in nato počasno ohlajanje proti -196°C.
Raziščite to praktično orodje
Uporabite interaktivno orodje za raziskovanje vprašanja v tem članku.
Nalaganje interaktivnega orodja ...
Za nadaljnje branje