Zakaj je kriopreservacija pri -196 stopinjah Celzija?

Tole je vprašanje, ki ga velja jemati povsem dobesedno: kaj pravzaprav želimo doseči, ko ohranjamo človeka? Odgovor ni, da bi ga zgolj ohladili. Mraz je metoda, nikoli cilj. Cilj je zaustaviti biološke procese tako temeljito, da razlika med enim letom in deset tisoč leti ne bi več imela pomena. Skoraj vse drugo, tudi tista nenavadno natančna številka v naslovu, izhaja neposredno iz te ene zahteve.

Smiselno vprašanje torej ni, zakaj je treba ohladiti tako močno. Vprašanje je: kako mrzlo mora biti, da se kemija ustavi? Ta meja je temperatura steklastega prehoda raztopine krioprotektantov, približno -130°C. Pod njo je gibanje molekul tako omejeno, da se presnovni in drugi kemijski procesi praktično ustavijo. -196°C ni ta meja. Gre za vrelišče tekočega dušika, ki je precej pod odločilno mejo in pri tej temperaturi ostaja brez aktivnega hlajenja.

Razpad je le kemija, ki se še ni ustavila

Ko rečemo, da telo razpada, pravzaprav govorimo o kemiji: encimi cepijo molekule, potekajo reakcije, mikrobi počnejo tisto, kar mikrobi počnejo. Vsak od teh procesov potrebuje gibanje in trke molekul. Če upočasnimo gibanje, upočasnimo kemijo. Če jih dovolj upočasnimo, se ti procesi za praktične namene ustavijo.

Tu velja preprosto pravilo. Kot grobo pravilo velja, da znižanje temperature za približno 10°C približno prepolovi hitrost mnogih kemijskih reakcij. To ne zveni dramatično, dokler teh prepolovitev ne naložimo eno na drugo. Prehod od telesne temperature do globokega mraza razgradnje ne upočasni le za dva- ali desetkrat, temveč za velikostne razrede z izjemno velikim številom ničel. Tekma s celičnim razpadom, ki se začne, ko srce obstane, je bistveno temperaturo dovolj hitro znižati, da nadaljnji potek teh procesov ne bo več pomemben.

Ključna razlika je med nastankom ledu in vitrifikacijo.

Nekdo bi si morda mislil, da gre preprosto za to, da človeka zamrznemo. Ni tako, in vzrok je voda. Voda med zmrzovanjem tvori kristale, ki se širijo ter lahko poškodujejo celične membrane in občutljive tkivne strukture. Kristali pa niso edina težava. Ko voda kristalizira, se soli in druge raztopljene snovi izločijo iz ledenih kristalov ter se skoncentrirajo v preostali tekočini. Celice, ki se znajdejo v tej vse bolj zgoščeni raztopini, izgubljajo vodo in se osmotsko poškodujejo. Do poškodb lahko pride tudi brez neposrednega stika celic z ledenimi kristali. Zamrzniti človeka na način, kot zamrznemo zrezek, bi bilo učinkovit način, da uničimo prav to, kar poskušamo ohraniti.

Temu se poskušamo izogniti z vitrifikacijo. Večji del telesne vode nadomestimo s krioprotektivnimi sredstvi, ki delujejo podobno kot medicinski antifriz, nato pa tkivo ohlajamo tako, da ne nastanejo ledeni kristali. Namesto tega preide v steklasto stanje, torej v trdno stanje brez ledu in brez poškodb, ki jih povzročajo ledeni kristali. Vitrificirano tkivo je v vsakdanjem pomenu besede zamrznjeno, saj je zelo hladno in trdno, vendar v njem ne nastajajo uničujoči ledeni kristali. Ta razlika je bistvo cele zgodbe.

Številka, ki resnično šteje, je okoli -130°C

Tu pride del, ki mnoge preseneti: temperatura, ki je resnično odločilna, sploh ni -196°C. Odločilna je temperatura steklastega prehoda, nekje okoli -130°C, meja, pod katero se vitrificirano stanje trdno zaklene. Nad njo se steklasto stanje lahko počasi sprošča. Še huje, lahko se začne rekristalizacija. Rekristalizacija pomeni poznejši nastanek ledu v prej vitrificiranem materialu. Pod to mejo se gibanje molekul upočasni tako močno, da struktura preprosto obstane.

Če je torej -130°C točka, pri kateri steklasto stanje postane stabilno, zakaj sploh ohlajati vse do -196°C? Tudi tu potrebujemo varnostno rezervo, podobno kot je pri zamrzovalniku ne nastavimo natanko na 0°C. Če tkivo hranimo več kot 60 stopinj pod temperaturo steklastega prehoda, ostane globoko znotraj varnega območja, daleč od vsake temperature, pri kateri bi se steklasto stanje lahko zmehčalo ali bi se led lahko vrnil. Tako stanje, ki je stabilno le ob idealnih razmerah, postane stabilnejše tudi ob odstopanjih. Pri ohranjanju človeškega telesa je takšna rezerva ključna.

Zakaj ravno -196? Tekoči dušik omogoča pasivno uravnavanje temperature.

Temperatura -196°C ni poljubno določena. To je temperatura vrelišča tekočega dušika, zato je za takšno shranjevanje izjemno priročna.

Vrela tekočina ohranja temperaturo vrelišča. Dokler je v posodi tekoči dušik, njena vsebina ostaja pri -196°C, ne toplejša in ne hladnejša, ne glede na razmere v prostoru. Gre za samouravnavajoč termostat brez gibljivih delov, brez kompresorja in, kar je najpomembneje, brez odvisnosti od elektrike. Paciente in vzorce hranimo v vakuumsko izoliranih dewarjih, posodah po načelu termovke, ki močno omejujejo dotok toplote. Edino redno vzdrževanje je dolivanje dušika, ki počasi izhlapeva. V nasprotju z mehanskim zamrzovalnikom sistem ne potrebuje stalnega električnega napajanja. Lastnosti tekočega dušika niso odvisne od zanesljivosti lokalnega električnega omrežja.

Dušik je poleg tega poceni, na voljo v izobilju (predstavlja večino zraka, ki ga prav zdaj dihamo), je inerten in ni vnetljiv. Za dolgotrajno shranjevanje bi težko zasnovali primernejše hladilno sredstvo od snovi, ki jo pridobivamo iz ozračja.

Cena tako globokega hlajenja

Pasivno hlajenje s tekočim dušikom ima tudi svojo pomanjkljivost. Med temperaturo steklastega prehoda in -196°C je še dodatnih šestinšestdeset stopinj hlajenja, vitrificirana trdna snov pa se ves ta čas krči. V tem območju je snov že krhka, zato se napetosti zaradi krčenja ne morejo več sproščati. To ustvari mehansko napetost, ki jo material nad določenim pragom sprosti tako, da poči.

Ta učinek je mogoče ponoviti v laboratoriju. Pokanje vitrificiranih raztopin krioprotektantov je povezano s toplotnim krčenjem in temperaturnimi gradienti, ki nastanejo pri hitrem ohlajanju večjih predmetov. Raztopine z višjo temperaturo steklastega prehoda pokajo redkeje, ker se po prehodu v trdno stanje ohladijo za manjši temperaturni razpon.

Ohranjanje celotnega telesa je najzahtevnejši primer. Razpoke se navadno začnejo pod temperaturo steklastega prehoda. Če je perfuzija s krioprotektantom potekala slabo, se lahko razpoke pojavijo že pri komaj -90°C. Razpoke so lahko vidne s prostim očesom ali pa so mikroskopske. Razpoka loči tkivo vzdolž določene ravnine, ne da bi ga zdrobila, vendar je vsaka takšna ločitev poškodba, ki bi jo bilo treba v prihodnosti popraviti.

Trenutna rešitev je zelo počasno ohlajanje. Celotno ohlajanje traja skoraj teden dni. Spust skozi temperaturo steklastega prehoda in pod njo je najpočasnejši del postopka, ki poteka pod računalniškim nadzorom s hitrostjo približno ene stopinje na uro. Počasnejše ohlajanje pomeni manjše gradiente, manjši gradienti pa pomenijo manj napetosti.

Vmesno temperaturno shranjevanje

Boljši odgovor je, da ohlajanje ustavimo prej. Vmesno temperaturno shranjevanje ohranja pacienta pri temperaturi okoli -140°C namesto pri -196°C. To je še vedno deset stopinj pod temperaturo steklastega prehoda, ne šestinšestdeset, tako da gibanje molekul ostaja zamrznjeno in nič ne razpada, ob tem pa je treba prestati precej manj krčenja.

Tehnična rešitev je povsem pasivna. Zaloga tekočega dušika je na dnu dewarja, pacient pa je nameščen v hladni pari nad njim, pri čemer je prostor s paro uravnavan na tarčno temperaturo. Brez kompresorja in brez odvisnosti od električnega omrežja, iz istega razloga, zaradi katerega tekočemu dušiku zaupamo pri shranjevanju že od začetka.

Prvi dewar za vmesno temperaturno shranjevanje v velikosti za odraslega človeka prispe v objekt European Biostasis Foundation v Švici avgusta 2026. Prva naloga je meritev dejanske porabe tekočega dušika, ker ta številka določa strošek shranjevanja pacienta za dobo enega stoletja. Vmesno temperaturno shranjevanje članom ne bo na voljo, dokler ta strošek ne bo znan.

Kaj se pri tako nizkih temperaturah dejansko ohrani

Pri -196°C se biološki čas praktično ustavi. Aktivnost encimov preneha, mikrobi se ne morejo razmnoževati, in spontane reakcije, ki bi sicer razgrajevale tkivo, nimajo dovolj energije, da bi lahko potekale. Molekularna zgradba telesa, zlasti možganov, se zato lahko dolgoročno ohrani.

Zadnja točka je tista, ki šteje najbolj. Biostaza temelji na predpostavki, da so lastnosti, ki posameznika določajo kot osebo, zapisane v fizični strukturi možganov, biostaza zlasti v njihovih povezavah in vzorcih. vi sami To obravnava besedilo »Spomin, identiteta in možgani«. Če to strukturo ohranimo nespremenjeno, ohranimo tudi informacijo, čeprav tehnologija, ki bi jo znala prebrati in obnoviti delovanje, še ne obstaja. Nizka temperatura sama po sebi ni rešitev vseh težav. Deluje kot izjemno učinkovit biološki premor, ki ohranjeni informaciji omogoča, da počaka na prihodnje tehnologije.

Nič od tega ne zahteva popolnega stroja ali neprekinjene oskrbe z elektriko. Zahteva steklasto stanje namesto ledu in temperaturo, ki je z veliko rezervo pod temperaturo steklastega prehoda. Zahteva tudi vrelo tekočino, ki se sama ustali natanko na pravi vrednosti. V tem je prednost temperature -196°C: pri njej lahko ohranjeno telo dolgoročno ostane v stabilnem stanju.

Za nadaljnje branje

• Zakaj ne moremo kriopreservirati človeka, ki je še živ?
• Ohranjanje brez zamrzovanja
• Zakaj oživitev trenutno ni mogoča?
• Kritični slovarček